shkolageo.ru   1 2 3

Рис. 5. Активность Rho необходима для сборки тангенциальных и радиальных АК. Звёздочками обозначены клетки с введённым раствором декстрана (контроль) либо С3 трансферазы и декстрана. Стрелками обозначены АК контрольных клеток. Флажками обозначены зоны контакта двух клеток, загруженных С3 трансферазой.



3.2. Влияние ингибирования контрактильности актина-миозина на сборку АК.

Чтобы оценить влияние эффекторов Rho на формирование АК различных типов, в первую очередь мы исследовали влияние Y-27632, специфического ингибитора ROCK, на формирование тангенциальных АК нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2 и радиальных АК трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1 и фибробластов Rat-1 (рис. 6). Клеточные монослои ранили и через 20 мин переносили в среду с ингибитором Rho-киназы Y-27632 и инкубировали в течение 2 ч. Затем клетки фиксировали и окрашивали на F-актин и либо E-, либо N-кадхерин. Инкубация в среде, содержащей Y-27632 в концентрации 30 мкМ, в течение 2-3 ч, приводила к разборке в клетках IAR-2 как краевого пучка, так и прямых актиновых пучков. Тем не менее в присутствии Y-27632 E-кадхерин аккумулировался в тангенциальных АК более волнистых, чем АК в контрольных клетках IAR-2.




Рис. 6. Влияние подавления активности ROCK и контрактильности актина-миозина на формирование АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR и фибробластов Rat-1. Флажками обозначены зоны межклеточного взаимодействия и АК в них.


В случае трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1, инкубация в среде с 30 мкМ Y-27632 также приводила к разрушению актиновых пучков. В отличие от тангенциальных АК нетрансформированных эпителиоцитов, радиальные E- кадхерин-содержащие АК в местах межклеточных контактов не собирались. На границах между клетками были видны исключительно точечные кластеры, состоявшие из E-кадхерина. Y-27632 (30 мкМ) разрушал актиновые пучки и приводил к полному подавлению формирования радиальных АК фибробластов Rat-1. В местах межклеточных взаимодействий были видны единичные точки, образованные N-кадхерином.

Хорошо известно, что Rho/ROCK-сигнальный путь контролирует в клетке создание миозин II-зависимых сил. Поэтому следующим этапом стала проверка влияния ингибитора АТФазы миозина II блеббистатина (Straight et al., 2003), на формирование тангенциальных и радиальных АК (рис. 6). Эксперименты показали, что тангенциальные АК в эпителиоцитах IAR-2 могут собираться без активного миозина II. В присутствии блеббистатина в концентрации 50 мкМ, происходило полное разрушение краевых и прямых актиновых пучков в клетках IAR-2. При этом E-кадхерин аккумулировался в волнистой линии вдоль границы между клетками.


Блеббистатин (50 мкМ) разрушал актиновые пучки и предотвращал формирование радиальных АК клеток IAR-6-1. В этих клетках были замечены только отдельные точечные и фрагментированные линейные контактные структуры в местах межклеточных взаимодействий. В случае клеток Rat-1 блеббистатин оказывал быстрый и сильный эффект на клеточную морфологию, актиновый цитоскелет и АК, что приводило к арборизации клеток. В экспериментах с фибробластами Rat-1 была использована меньшая концентрация блеббистатина (15 мкМ), при которой также происходило разрушение актиновых пучков и прекращалась сборка радиальных АК.

Для количественной оценки влияния Y-27632 и блеббистатина на аккумуляцию кадхерина в АК по ранее описанной методике (Carramusa et al., 2007) были измерены интенсивности флуоресценции E- и N-кадхерина в области межклеточных контактов. Анализ интенсивности флуоресценции показал, что Y-27632 и блеббистатин значительно уменьшали аккумуляцию E-кадхерина в АК трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1 и N-кадхерина в АК нетрансформированных фибробластов Rat-1. Напротив, в случае нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2 не было обнаружено значительного различия в средних уровнях флуоресценции E-кадхерина контрольных и обработанных ингибиторами клеток.

Приведённые данные показывают, что образование и поддержании радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток, так же как и радиальных АК фибробластов, зависит от обеспечиваемой миозином II контрактильности. Напротив, миозин II не требуется для сборки тангенциальных АК нетрансформированных эпителиальных клеток.

В работах Sahai and Marshall (2002) и Ivanov et al. (2005), было установлено, что миозин II-зависимая контрактильность не является непременным условием сборки АК эпителиальных клеток MDCK и T84. В результате более детальных исследований (Smutny et al., 2010) роли миозина в формировании АК эпителиальных клеток были получены данные о различных функциях изоформ немышечного миозина II в этом процессе. Предполагается, что миозин IIA задействован в аккумуляции кластеров кадхерина-катенина в АК, в то время как миозин IIB участвует в повышении количества актиновых филаментов в зоне АК.


В настоящем исследовании мы также обнаружили значительные изменения в межклеточных взаимодействиях, вызванные неопластической трансформацией. Формирование стабильного контакта между нетрансформированными эпителиальными клетками приводит к значительному ингибированию протрузий в месте контакта (контактный паралич) и к уменьшению протрузионной активности на свободных краях контактирующих клеток. Напротив, в трансформированных эпителиальных клетках контактный паралич не наблюдался. Как было показано ранее (Gloushankova et al., 1997; Krendel and Bonder, 1999), при контакте нетрансформированных эпителиоцитов в зоне АК происходит разрыв краевого актинового пучка и формирование на свободных краях контактирующих клеток аркоподобных актин-миозиновых структур, создающих тангенциальное натяжение в зоне межклеточного взаимодействия. Можно предположить, что тангенциальное натяжение аркоподобных актиновых пучков нетрансформированных эпителиальных клеток играет центральную роль в развитии контактного паралича. Ингибирование протрузионной активности приводит к стабилизации контакта между двумя клетками. Аналогичная супрессия протрузионной активности вследствие приложения искусственного тангенциального натяжения с помощью иглы микроманипулятора описана в работе Kolega (1986). Тангенциальное натяжение также может приводить к быстрому латеральному расширению контакта и выстраиванию вновь сформированных актиновых филаментов в периферические пучки, что способствует усилению адгезии. Можно предположить, что отсутствие краевых пучков у трансформированных эпителиальных клеток создаёт дефицит тангенциального натяжения на границе контактирующих клеток, что, в свою очередь, приводит к отсутствию подавления протрузионной активности при формировании контакта между клетками. Тем не менее, требуются дополнительные исследования для досконального выяснения роли изоформ немышечного миозина II при формировании различных типов АК.

Вместе с тем, миозин II-зависимая контрактильность является ключевым регулятором формирования радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток. Как было показано ранее, формирование радиальных АК фибробластов требует миозин II-зависимой контрактильности (Gloushankova et al., 1998; Miyake et al., 2006). Таким образом, радиальные АК трансформированных эпителиальных клеток и радиальные АК фибробластов регулируются сходным образом.



3.3. Влияние подавления экспрессии mDia1 на формирование АК.

При выяснении роли другого эффектора Rho, формина mDia1, в формировании АК, был применён метод РНК-интерференции для супрессии mDia1 в клетках (Yamana et al., 2006). Были использованы два типа дуплексов миРНК mDia1, имеющих одинаковый эффект. Субконфлюэнтные культуры были трансфицированы либо миРНК mDia1, либо контрольной миРНК GFP. Через 48 ч после трансфекции с помощью Вестерн-блоттинга клеточных лизатов была проверена эффективность супрессии mDia1. Как видно на рис. 7, трансфекция клеток миРНК mDia1 приводила к значительному подавлению экспрессии mDia1 в клетках всех трёх типов.

Рис. 7. Вестерн-блоттинг лизатов контрольных (1) клеточных культур и культур, трансфицированных GFP миРНК GFP (2) или одной из двух миРНК mDia1 (3, 4).


Для исследования влияния супрессии mDia1 на формирование АК через 48 ч после трансфекции в клеточных монослоях делали раны, затем их инкубировали в течение 4 ч, фиксировали и окрашивали одновременно на E-кадхерин и mDia1. Сравнение уровня иммунофлуоресцентного окрашивания mDia1 в культурах показало значительное уменьшение количества mDia1 в клетках через 48 ч после трансфекции. Супрессия mDia1 привела к значительным нарушениям формирования тангенциальных АК нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2 (рис. 8). Во всех клеточных парах со сниженным после трансфекции миРНК уровнем mDia1 не происходила сборка тангенциальных АК. В местах межклеточных контактов E-кадхерин аккумулировался исключительно в виде точечных кластеров. Эти данные согласуются с результатами Carramusa et al. (2007), показавшими исчезновение АК эпителиальных клеток при супрессии mDia1.

Рис. 8. Влияние подавления экспрессии mDia1 на формирование АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR и фибробластов. Стрелками и флажками обозначены АК.



Мы также сравнили влияние супрессии mDia1 при формировании радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток IAR-6-1 и фибробластов Rat-1. В отличие от тангенциальных АК, радиальные АК формировались клетками, несмотря на супрессию mDia1. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1 показало, что в клетках. трансфицированных миРНК mDia1, E-кадхерин аккумулировался в радиальных АК. Подавление экспрессии mDia1 также не оказывало влияния на сборку радиальных АК фибробластов Rat-1. Для того чтобы это продемонстрировать, была создана линия клеток Rat-1, стабильно экспрессирующих E-кадхерин, который колокализовался с N-кадхерином в АК. Далее, с помощью антител к E-кадхерину для выявления АК фибробластов Rat-1 и антител к mDia1 для выявления клеток, трансфицированных миРНК, было показано, что супрессия mDia1 не подавляла формирования радиальных АК фибробластов Rat-1.

Было также обнаружено, что интенсивность флуоресценции E-кадхерина в области межклеточных контактов нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2, трансфицированных миРНК mDia1, была снижена на ~50% по сравнению с контрольными клетками. Напротив, в случае клеток IAR-6-1 и Rat-1 значительных различий в уровнях флуоресценции кадхерина в зоне межклеточного контакта между трансфицированными миРНК mDia1 и контрольными клетками не было.

Таким образом, проведенные исследования показали, что mDia1, промотирующий нуклеацию актиновых филаментов, задействован в формировании тангенциальных АК нетрансформированных эпителиальных клеток IAR-2, но не участвует в сборке и поддержании радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток IAR-6-1 и фибробластов Rat-1.


3.4 Влияние введения N17Rac на формирование АК.

Ранее было показано, что Rac играет важную роль в формировании эпителиальных АК (Braga et al., 1997). В настоящей работе было выявлено изменение значения Rac для сборки АК в трансформированных эпителиоцитах. Для подавления активности Rac в клетки во время ранения монослоя вводили доминантно негативную форму этого белка (N17Rac) (рис. 9). При введении N17Rac в нетрансформированные эпителиоциты IAR-2 последние теряли способность формировать протяжённые тангенциальные АК. В клетках IAR-2, загруженных N17Rac, E-кадхерин мог аккумулироваться только в точечных агрегатах или в коротких линейных фрагментах в зоне межклеточного контакта. Напротив, N17Rac не оказывал видимого влияния на формирование радиальных E-кадхерин-содержащих АК трансформированных эпителиальных клеток IAR-6-1 и N- кадхерин-содержащих АК фибробластов Rat-1.


Мы также измеряли интенсивности флуоресценции E-кадхерина во вновь образованных межклеточных контактах клеток IAR-2 и IAR-6-1 и N-кадхерина в межклеточных контактах клеток Rat-1. Анализ этих данных показал, что интенсивность флуоресценции E-кадхерина в нетрансформированных эпителиоцитах IAR-2, загруженных N17Rac, снижалась в среднем на ~50% по сравнению с контрольными клетками. Напротив, в случае клеток IAR-6-1 и Rat-1 значительных различий в уровнях флуоресценции кадхерина между клетками, содержащими N17Rac, и контрольными клетками не было.

Полученные данные свидетельствуют о том, что сборка тангенциальных АК требует активности ГТФазы Rac. Напротив, формирование радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток и фибробластов не зависело от функционирования Rac. Таким образом, функциональные исследования продемонстрировали сходство в регуляции сборки радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток и радиальных АК фибробластов малыми ГТФазами семейства Rho. Ранее в работе Braga et al. (1999) было высказано предположение о том, что аккумуляция E-кадхерина может регулироваться малой ГТФазой Rac по-разному, в зависимости от клеточного контекста. Данные настоящего исследования показывают, что вовлечённость Rac-сигналинга в установлении E-кадхерин-зависимой адгезии зависит от пространственной организации формирующихся АК.


Рис. 9. Влияние введения N17Rac на формирование АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR и фибробластов. Звёздочками обозначены клетки, загруженные С3 трансферазой. Флажками обозначены зоны межклеточных контактов, в которых происходит аккумуляция кадхеринов.



<< предыдущая страница   следующая страница >>