shkolageo.ru 1 2 3

На правах рукописи




АЙОЛЛО Дмитрий Владимирович




ДИНАМИКА ФОРМИРОВАНИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ АДГЕЗИОННЫХ КОНТАКТОВ И ПЕРЕСТРОЕК АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА НЕТРАНСФОРМИРОВАННЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК




Специальность 14.01.12 – Онкология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва 2011

Работа выполнена в лаборатории механизмов канцерогенеза НИИ Канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра имени Н.Н. Блохина РАМН


Научный руководитель: доктор биологических наук

Глушанкова Наталия Александровна


Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Красильников Михаил Александрович


доктор биологических наук, профессор

Надеждина Елена Сергеевна


Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова


Защита диссертации состоится « » 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02) РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН по адресу 115478 Москва, Каширское шоссе, 24


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.


Автореферат разослан «___»_____________ 2011 года.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Межклеточные адгезионные контакты (АК) образованы кадхеринами, которые через сложный белковый комплекс адгезионной бляшки ассоциированы с актиновыми микрофиламентами. АК нормальных эпителиальных клеток играют важнейшую роль в поддержании целостности эпителиальных пластов, обеспечивая механическое соединение клеток. При опухолевой трансформации клеток эпителиального происхождения разрушается стабильная межклеточная адгезия. Одним из следствий нарушений межклеточной адгезии является приобретение трансформированными клетками способности к инвазии. Во многих карциномах наблюдается эпигенетическое подавление экспрессии гена Е-кадхерина CDH1. Однако описаны некоторые опухоли эпителиального происхождения, в которых сохраняется экспрессия E-кадхерина. Из этого можно сделать вывод, что межклеточная адгезия может нарушаться без подавления экспрессии E-кадхерина. Исследования трансформированных эпителиальных линий, клетки которых экспрессируют E-кадхерин, могут прояснить механизмы нарушения межклеточной адгезии при опухолевой трансформации.


Хорошо известны различия в организации актинового цитоскелета и АК клеток двух тканевых типов: эпителиоцитов и фибробластов. АК эпителиоцитов образованы Е-кадхерином, имеют тангенциальную организацию и связаны с периферическим актиновым пучком. Нормальные фибробласты имеют радиальную организацию АК, ориентированных перпендикулярно межклеточной границе и ассоциированных с прямыми актиновыми пучками (Yonemura et al., 1995). Формирование АК фибробластов существенным образом зависит от контрактильности актина-миозина (Gloushankova et al., 1998, Miyake, 2006). Вместе с тем до сих пор не были исследованы закономерности формирования АК трансформированных эпителиоцитов, не были исследованы межклеточные взаимодействия эпителиоцитов, сохранивших при трансформации экспрессию Е-кадхерина. Помимо этого остаётся невыясненным функциональное значение изменений актинового цитоскелета, особенно потери краевого актинового пучка, в ослаблении межклеточной адгезии при трансформации эпителиоцитов.

На современном этапе общепризнанной считается роль малых ГТФаз семейства Rho в регуляции перестроек актинового цитоскелета (Heasman and Ridley, 2008). Имеются также данные о вкладе Rho ГТФаз в построение АК эпителиальных клеток. Сравнительные исследования роли ГТФаз Rho и Rac в нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитах могут прояснить их вклад в разрушение стабильной межклеточной адгезии при трансформации.

В последнее время использование рекомбинантных внутриклеточных белков, меченных флуоресцентными красителями, позволило проводить исследования динамики формирования АК и структур актинового цитоскелета в живых клетках. Изучение распределения меченых белков АК трансформированных и нетрансформированных эпителиоцитов при формировании межклеточных контактов может предоставить важные данные о самых ранних этапах формирования АК. Также, это может выявить различия в белковой организации АК нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток.

Таким образом, изучение динамики формирования АК, её связи с перестройками актинового цитоскелета и малыми ГТФазами семейства Rho и её изменений в результате неопластической трансформации является одной из важнейших задач современной экспериментальной онкологии.


Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является выявление различий в организации, динамике, формировании и регуляции АК нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток в культуре.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительные исследования организации актинового цитоскелета и АК нетрансформированных эпителиоцитов линии IAR-2, и эпителиоцитов линии IAR-6-1, трансформированных диметилнитрозамином.

2. Сравнить динамику АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов.

3. Изучить особенности формирования АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов.

4. Изучить аккумуляцию актина и зиксина в АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов.

5. Исследовать роль малых ГТФаз семейства Rho (Rac и Rho) и их эффекторов в формировании АК.


Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе впервые обнаружены различия в организации, динамике, формировании и регуляции сборки АК малыми ГТФазами семейства Rho в нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клетках.

В работе впервые установлено, что при неопластической трансформации в культурах эпителиальных клеток IAR, несмотря на сохранение экспрессии Е-кадхерина, утрата краевого актинового пучка сопровождается изменением пространственной организации E-кадхерин-содержащих АК. При трансформации эпителиоцитов непрерывные тангенциальные АК заменяются радиальными АК. Было показано, что подобное изменение пространственной организации АК сопровождается разрушением стабильной межклеточной адгезии. В трансформированных эпителиальных клетках IAR-6-1 стабильные АК замещаются динамичными АК.


В настоящей работе впервые было выявлено, что АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов формируются по-разному. Начальные точечные АК нетрансформированных эпителиальных клеток IAR-2 претерпевают латеральное расширение и формируют зрелый тангенциальный АК вдоль межклеточной границы. В случае трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1, в перекрывающихся ламеллах контактирующих клеток начальные точечные АК растут и превращаются в индивидуальные радиальные АК, ориентированные перпендикулярно межклеточной границе и ассоциированные с прямыми актиновыми пучками.

Было обнаружено, что формирование АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR требует активности малой ГТФазы Rho. При этом формирование тангенциальных АК нетрансформированных эпителиальных клеток зависит от активности эффектора Rho mDia1 и не зависит от активности другого эффектора Rho ROCK. Впервые обнаружено, что формирование радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток, напротив, не зависит от активности mDia1 и требует активности ROCK и индуцируемой ею контрактильности актина-миозина. Помимо этого было показано, что формирование тангенциальных АК нетрансформированных эпителиальных клеток зависит от активности малой ГТФазы Rac. Напротив, формирование радиальных АК трансформированных эпителиальных клеток может происходить и в условиях ингибирования активности Rac.

Полученные результаты выявляют неизвестные ранее закономерности реорганизации Е-кадхерин-содержащих АК при неопластической трансформации и их взаимосвязь с функционированием малых ГТФаз семейства Rho и перестройками актинового цитоскелета. Наряду с теоретическим, полученные данные имеют научно-практическое значение при разработке подходов в диагностике ранних стадий злокачественных опухолей эпителиального происхождения. Перестройки актинового цитоскелета и АК могут использоваться в качестве признаков, которые помогут в выявлении клеток, находящихся на ранних этапах неопластической трансформации.



Апробация работы

Диссертация апробирована на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, генетики опухолевых клеток НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и отдела математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ 29 сентября 2010 г.

Материалы диссертационной работы были представлены на XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006); на всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), на школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала (Санкт-Петербург, 2009), а также на международной школе-конференции «Биология – наука XXI века (Пущино, 2009).


Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.


Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 112 страницах, содержит 24 рисунка и состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и Методы, Результаты, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Список литературы включает 251 цитируемый источник.


ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты. В работе были использованы ингибитор ROCK Y-27632 и ингибитор АТФазы миозина II (±)-блеббистатин (Calbiochem, Merck). Были использованы следующие первичные моноклональные антитела: анти-E-кадхерин, клон 36; анти-N-кадхерин, клон 32; анти-mDia1, клон 51 (Transduction Laboratories, BD); анти-α-тубулин, клон DM1A (Sigma-Aldrich). Также были использованы вторичные антитела, меченные TRITC (Chemicon); вторичные антитела, меченные Alexa488; фаллоидин, меченный Alexa488 и TRITC (Molecular Probes, Invitrogen); вторичные антитела к изотипам мышиных антител IgG1 и IgG2a (Southern Biotech); вторичные антитела для Вестерн-блоттинга, конъюгированные с пероксидазой хрена (Upstate, Millipore). Остальные использованные реагенты были произведены фирмой Sigma-Aldrich.



Клеточные линии и трансфекция. Линия иммортализованных нетрансформированных эпителиальных клеток IAR-2 была получена из эксплантата крысиной печени. Линия трансформированных эпителиальных клеток IAR-6-1 была получена путём обработки клеток IAR диметилнитрозамином (Montesano et al., 1973). Линия иммортализованных нетрансформированных фибробластов Rat-1 была получена из эмбрионов крыс (Steinberg et al., 1978). Клетки культивировали в среде DMEM с 10% FBS, пенициллином и стрептомицином при 37°C в увлажняемой атмосфере с 5% CO2.

Конструкты, экспрессирующие E-кадхерин и GFP-E-кадхерин, были любезно предоставлены проф. С.М. Трояновским (Северо-Западный Университет, Чикаго, США). С помощью трансфекции были получены линии эпителиальных клеток IAR-2 и IAR-6-1, стабильно экспрессирующих GFP-E-кадхерин. Трансфекцию производили с помощью реагента FuGene6 (Roche). Стабильность трансфекции достигалась двухнедельной селекцией в среде, содержащей G-418. Затем культуры клонировали на 96-луночных плашках в селективной среде.

Для исследования аккумуляции актина, зиксина и α-актинина клетки IAR-2 и IAR-6-1, стабильно экспрессирующие GFP-E-кадхерин, трансфицировали одной из трёх плазмид: TagRFP-актин (Евроген), mKate-зиксин или mKate2-α-актинин (Евроген). Трансфекцию производили с помощью реагентов Lipofectamine LTX и PLUS (Invitrogen). Спустя сутки после трансфекции культуры использовали в экспериментах.

Ингибирование Rho и Rac. Для выявления влияния ингибирования Rho и Rac на формирование АК в узкой ране были использованы C3 трансфераза и доминантно негативная форма Rac (N17Rac), любезно предоставленные проф. A. Холлом (Мемориальный онкологический центр Слоун-Кеттеринг, США). N17Rac и C3 трансферазу получали путём экспрессии в клетках E. coli рекомбинантного белка (Self and Hall, 1995). C3 трансфераза и N17Rac вводили в клетки края раны модифицированным методом Брока с соавторами (Brock et al, 1996). Флуоресцентно меченный декстран в этом случае выступал в качестве индикатора попадания раствора в клетку.



РНК интерференция. Методика РНК-интерференции была использована для супрессии mDia1 в клетках. Для подавления экспрессии mDia1 были использованы миРНК A6 и K2 (Yamana et al., 2006) к участкам нуклеотидной последовательности гена Diaph1 184-209 (5'-GCGACGGCGGCAAACATAAGAAATT-3') и 795-813 (5'-GCTGGTCAGAGCCATGGAT-3'). миРНК, синтезированные в виде одноцепочечных молекул РНК (Syntol), затем отжигали для получения дуплексов (Tuschl et al., 1999). Трансфекцию производили с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Спустя 36-48 ч после трансфекции клеточные культуры либо использовали в экспериментах по схождению клеток в узкой ране, либо анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. В качестве контроля использовали GFP миРНК (5'-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT-3').


Флуоресцентное окрашивание и микроскопия. Для окрашивания E- или N-кадхерина клетки фиксировали метанол-ацетоном (1:1) при -20°С в течение 10 мин. Для двойного окрашивания E- или N-кадхерина и актина клетки фиксировали 1% раствором PFA и обрабатывали 0,5% раствором детергента Triton X-100 в течение 5 мин. Для визуализации mDia1 клетки фиксировали 3,7% раствором PFA и обрабатывали раствором детергента. Фиксированные препараты инкубировали с первичными и вторичными антителами в течение 40 мин. Меченый фаллоидин, добавляли к раствору вторичных антител. Фиксированные образцы исследовали с помощью микроскопа Zeiss Axioplan, оснащённого объективом 100× (NA 1.4). Фотографии препаратов получали с помощью камеры ORCA-ER (Hamamatsu Photonics) и программы Wasabi 1.5.

Интенсивность флуоресценции E- и N-кадхерина в межклеточных контактах измеряли по описанной ранее методике (Carramusa et al., 2007) с помощью программы ImageJ (Национальный институт здоровья, США).

Видеосъёмка и анализ видеоизображений. При видеосъёмке использовали микроскоп Nikon Eclipse-Ti, оснащённый объективом Plan-Neofluar 100× (NA 1.3) DIC. Видеосъёмку производили с помощью камеры ORCA-ER (Hamamatsu Photonics) и программы NIS-Elements AR2.3 (Nikon). В некоторых случаях был использован конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Leica TCS SP5, оснащённый объективами HCX PL APO 63x/1.40 oil CS и HCX PL APO 100x/1.40 CS и комплексом лазеров (HeNe 10 мВт 633 нм, HeNe 1 мВт 543 нм, Ar 100 мВт 458.476.488.496.514 нм). С помощью программы ImageJ и метода карт расстояний (Beraud et al., 2009) в клетках, стабильно экспрессирующих GFP-E-кадхерин, были определены расстояния, преодолеваемые индивидуальными АК, и вычислены средние скорости их движения.



Вестерн-блоттинг. Клеточные лизаты разделяли с помощью гель-электрофореза в 10% полиакриламидном геле с SDS и переносили на PVDF мембраны (GE Healthcare) с использованием ячейки Mini-Protean 3 Cell (Bio-Rad). Для выявления белков использовали специфичные первичные антитела и вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой. Детекцию белковых полос осуществляли с помощью набора ECL Plus (GE Healthcare) и системы для визуализации хемилюминесценции Chemi-Smart 2000 (Vilber Lourmat) в комплексе с компьютерной программой Chemi Capt.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ


1. Организация АК и актинового цитоскелета нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2 и трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1.

Большинство описаний трансформированных эпителиальных клеток in vitro было сфокусировано на клеточных линиях, претерпевших эпителиально- мезенхимальный переход (ЭМП), в связи с тем, что программа ЭМП, при которой эпителиоциты превращаются в фибробластоподобные клетки, способные к миграции, в настоящее время рассматривается в качестве главного механизма диссеминации опухолевых клеток эпителиального происхождения.

В рамках данной работы мы исследовали морфологию, актиновый цитоскелет и АК эпителиальной клеточной линии IAR-6-1, трансформированной диметилнитрозамином in vitro, которая давала опухоли в сингенных крысах (Montesano et al., 1973). Как показала дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия, морфология клеток этой линии не очень заметно отличалась от клеток линии нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2. В плотной культуре нетрансформированные эпителиальные клетки IAR-2 формировали монослой (рис. 1). Одиночные клетки IAR-2 имели дисковидную форму. В них присутствовал краевой актиновый пучок, типичный для свободного края эпителиальных клеток, а также внутренние прямые актиновые пучки. Иммунофлуоресцентная микроскопия клеток IAR-2, окрашенных антителами к E-кадхерину, показала, что АК в этих клетках выстраивались в непрерывную линию вдоль межклеточных границ и колокализовались с периферическим актиновым пучком. АК нетрансформированных эпителиальных клеток были названы "тангенциальными АК".





Рис. 1. Морфология монослоя и организация АК (стрелки) и актинового цитоскелета нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2 и трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1. Флажками обозначены актиновые пучки.


Одиночные клетки IAR-6-1 имели полигональную форму (рис. 1). В конфлюэнтной культуре клетки IAR-6-1 также как и клетки IAR-2 формировали монослой. Анализ с помощью Вестерн-блоттинга показал, что трансформированные эпителиальные клетки IAR-6-1 сохраняли экспрессию эпителиального E-кадхерина и не экспрессировали мезенхимальный N-кадхерин. Существенные различия между нетрансформированными эпителиоцитами IAR-2 и трансформированными эпителиоцитами IAR-6-1 были выявлены при флуоресцентном окрашивании на актиновый цитоскелет и E-кадхерин. В отличие от нетрансформированных клеток IAR-2, в клетках IAR-6-1 не обнаруживались краевые актиновые пучки, в цитоплазме имелись только произвольно ориентированные прямые актиновые пучки. Также в клетках IAR-6-1 происходила существенная перестройка E-кадхерин-содержащих АК, которые представляли собой «штрихи», выстроенные перпендикулярно или под различными углами к межклеточной границе. АК трансформированных эпителиальных клеток были названы "радиальными АК". Двойное флуоресцентное окрашивание показало, что АК в трансформированных клетках IAR-6-1 колокализованы с короткими прямыми актиновыми пучками. В густых культурах с высокой плотностью некоторые АК были ориентированы вдоль межклеточных границ.

Таким образом, при исследовании эпителиоцитов IAR-6-1, трансформированных химическим канцерогеном, нам удалось обнаружить реорганизацию актинового цитоскелета и пространственной организации АК при сохранении экспрессии Е-кадхерина в клетках. Неопластическая трансформация приводила к исчезновению краевого пучка в эпителиоцитах, разрушению адгезионного пояса и превращению тангенциальных АК в радиальные АК. По морфологии Е-кадхерин-содержащие АК трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1 были похожи на N-кадхерин-содержащие АК клеток мезенхимального происхождения – фибробластов (См. Yonemura et al., 1995, Gloushankova et al., 1998).



2. Анализ динамики Е-кадхерин-содержащих АК.

Видеомикроскопические исследования, выполненные И.Ю. Житняк в нашей лаборатории, продемонстрировали, что неопластическая трансформация привела к разрушению стабильной адгезии между эпителиальными клетками IAR-6-1 и появлению у них локомоторной активности. Вместе с тем, мы показали, что трансформированные эпителиоциты IAR-6-1 продолжают экспрессировать Е-кадхерин, характерный для нормальных эпителиоцитов. Используя конструкцию GFP-Е-кадхерина, мы решили провести сравнительные исследования закономерностей формирования Е-кадхерин-содержащих АК в нетрансформированных эпителиоцитах IAR-2 и клетках IAR-6-1. В результате трансфекции и последующей селекции были созданы линии нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2 и трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1, стабильно экспрессирующие GFP-E-кадхерин. С использованием прижизненной флуоресцентной и DIC микроскопии клетки были исследованы на протяжении 3-7 ч.


2.1. Анализ динамики АК в редкой культуре.

В случае нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2 E-кадхерин аккумулировался в стабильных протяжённых тангенциальных АК на границах между клетками. Эти контакты оставались стабильными на протяжении всего времени наблюдения. АК трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1, напротив, были динамичными. Клетки IAR-6-1 формировали протрузии по всей периферии. Когда протрузия одной клетки контактировала с другой клеткой, начиналась аккумуляция GFP-E-кадхерина в точечных кластерах в месте межклеточного контакта. Точечные кластеры со временем увеличивались в размере. АК клеток IAR-6-1 претерпевали ремоделинг, перестраиваясь и перемещаясь в зоне контакта. В отличие от стабильных АК нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2, АК в трансформированных эпителиоцитах IAR-6-1 были нестабильными. Контакт между двумя клетками часто разрывался, после чего отсоединившаяся клетка могла формировать контакт с другим партнёром. Клетки IAR-6-1 могли перемещаться по субстрату и формировать динамичные E- кадхерин-содержащие межклеточные контакты с соседними клетками.


С помощью метода карт расстояний (Beraud et al., 2009) был проведён анализ перемещений АК в клетках IAR-2 и IAR-6-1, стабильно экспрессирующих GFP-E-кадхерин. Были обнаружены различия в динамике АК клеток IAR-2 и IAR-6-1. В то время как средняя скорость перемещения тангенциальных АК клеток IAR-2 составляла 59±3 нм/мин (n=28), средняя скорость перемещения радиальных АК клеток IAR-6-1 составила 189±21 нм/мин (n=30). Далее, с помощью программы ImageJ были измерены расстояния, которые преодолевали индивидуальные АК, и на основе этого также были подсчитаны средние скорости движения АК. Такой способ подсчёта дал аналогичный результат: средняя скорость перемещения АК клеток IAR-2 составила 97±17 нм/мин (n=25), средняя скорость перемещения АК клеток IAR-6-1 составила 176±22 нм/мин (n=25).

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали, что в отличие от стабильных тангенциальных АК нетрансформированных эпителиоцитов, радиальные E-кадхерин-содержащие АК трансформированных клеток очень динамичны. Они подвержены постоянным перестройкам. Вследствие этого трансформированные эпителиоциты IAR-6-1 могут разрывать существующие контакты и устанавливать новые контакты с соседними клетками, что может приводить к разрушению стабильной межклеточной адгезии, характерной для клеток эпителиального происхождения.


2.2. Динамика формирования АК при схождении узкой раны.

Используя систему узкой раны, далее мы решили детально сравнить процесс формирования АК в культурах нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов. В клеточном монослое при помощи инъекционной иглы делали рану (около 100 мкм) и через 2-4 часа наблюдали за формированием новых межклеточных контактов при движении двух клеточных пластов навстречу друг другу.

Прижизненная видеомикроскопия культур IAR-2 показала, что во время установления межклеточного контакта GFP-E-кадхерин аккумулировался на границе между клетками. Точечные кластеры GFP-E-кадхерина в течение 3-4 мин сливались в тангенциальную линию, которая латерально расширялась в обе стороны (рис. 2). В течение первых 5-10 мин после возникновения стабильного контакта клетки формировали ламеллиподии как в зоне контакта, так и на свободных краях. В течение следующих 15-20 мин, происходило полное подавление протрузионной активности вдоль всего контакта (контактный паралич). Он начинался одновременно по всей длине контакта. Клетки продолжали формировать небольшие ламеллиподии только на краях контакта. Контактный паралич не распространялся на свободные края контактирующих клеток. Вместе с тем некоторое снижение протрузионной активности на свободных краях контактирующих клеток также было выявлено.


В культуре трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1 характер аккумуляции GFP-E-кадхерина в местах межклеточных контактов был совсем другим (рис. 2). Вначале в области перекрывания ламелл двух клеток происходила агрегация GFP-E-кадхерина в точечных кластерах. Некоторые из этих точек могли исчезать. Большинство кластеров GFP-E-кадхерина росли и превращались радиальные штрихи, ориентированные перпендикулярно к межклеточной границе. АК могли менять своё положение. При смещении клеток в монослое друг относительно друга часто происходило удлинение и разрыв АК. У трансформированных эпителиальных клеток IAR-6-1 не был выявлен контактный паралич. После формирования межклеточного контакта клетки IAR-6-1 с прежней интенсивностью продолжали формировать ламеллиподии как в зоне контакта, так и на свободных краях.


Рис. 2. Динамика GFP-Е-кадхерина в нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитах IAR при схождении узкой раны. Флажками обозначены формирующиеся АК, а стрелками – соответствующие им места взаимодействия ламелл контактирующих клеток.


Таким образом, были показаны различия E-кадхерин-содержащих АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов. Нетрансформированные эпителиальные клетки формируют точечные АК, которые претерпевают латеральное расширение и образуют стабильные непрерывные тангенциальные АК вдоль межклеточной границы. В перекрывающихся ламеллах трансформированных эпителиальных клеток возникающие вначале точечные АК со временем превращаются в радиальные АК, ориентированные перпендикулярно межклеточной границе.


2.3. Исследование аккумуляции актина, зиксина и α-актинина при формировании АК.

Непременным условием формирования АК является их связь со структурами актинового цитоскелета. Эта связь осуществляется за счёт комплекса адаптерных белков адгезионной бляшки. В связи с этим в работе была исследована аккумуляция в АК актина, зиксина и α-актинина. При формировании АК зиксин выступает в роли регулятора перестроек F-актина и взаимодействует с VASP (Hansen and Beckerle, 2006).


Для этих исследования была использована временная трансфекция нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов, стабильно экспрессирующих GFP-E-кадхерин, плазмидами, кодирующими соответствующие флуоресцентно меченные белки. Видеосъёмка клеток производилась спустя сутки после трансфекции, на конфокальном микроскопе одновременно в двух каналах флуоресценции.

В данном исследовании была использована плазмида, кодирующая TagRFP-актин. При экспрессии рекомбинантный белок встраивался в разнообразные структуры актинового цитоскелета. При этом динамика формирования АК и морфология трансфицированных клеток не претерпевали видимых изменений. На начальном этапе формирования контакта нетрансформированных эпителиальных клеток IAR-2 мы наблюдали взаимодействие точечных агрегатов GFP-Е-кадхерина с короткими тонкими актиновыми пучками, ориентированными перпендикулярно межклеточной границе. Параллельно с этим в зоне межклеточного контакта происходило разрушение краевого актинового пучка. По мере формирования и латерального расширения АК вдоль него начинал образовываться периферический актиновый пучок. Сходную динамику перестройки актиновых пучков в зоне межклеточного контакта эпителиоцитов IAR-2 наблюдали также Крендель и Бондер (Krendel and Bonder, 1999) при введении в клетки меченного родамином фаллоидина. Вместе с тем высокие концентрации фаллоидина, использованные в данной работе, могли изменить динамику филаментного актина, поэтому для исследования реорганизации актинового цитоскелета в зоне контакта мы предпочли использовать плазмиду TagRFP-актин, продуктом которой в клетке является флуоресцентно меченный G-актин, активно встраивающийся в актиновые филаменты.

В случае трансформированных эпителиальных клеток IAR-6-1 в зоне контакта двух клеток возникали первичные точечные АК, с которыми связывались короткие прямые актиновые пучки. По мере удлинения точечных АК и их превращения в радиальные АК происходило удлинение и утолщение ассоциированных с ними прямых актиновых пучков.


Поведение зиксина при формировании АК исследовали с помощью плазмиды, кодирующей mKate-зиксин. Нетрансформированные эпителиальные клетки IAR-2 аккумулировали зиксин в местах возникновения начальных E-кадхерин-содержащих точечных кластеров (рис. 3). Зоны аккумуляции зиксина совпадали с зонами аккумуляции GFP-Е-кадхерина на всём протяжении формирования тангенциального АК.

Трансформированные эпителиоциты IAR-6-1 аккумулировали зиксин в зоне контакта двух клеток с момента возникновения первичных точечных АК (рис. 3). Одновременно с превращением точечных АК в радиальные, зоны аккумуляции зиксина также принимали форму радиальных штрихов, соответствовавших по размеру и ориентации АК, с которыми они взаимодействовали.

Помимо динамики аккумуляции актина и зиксина при формировании АК, в трансформированных эпителиоцитах IAR-6-1 также была исследована аккумуляция α-актинина. α-Актинин формирует поперечные сшивки между актиновыми филаментами и необходим для сборки актиновых пучков. В зоне межклеточного взаимодействия клеток IAR-6-1 α-актинин начинал аккумулироваться на стадии точечных АК (рис. 4). При этом зона его аккумуляции на начальном этапе совпадала с агрегатом GFP-Е-кадхерина. Затем, по мере превращения точечного АК в радиальный, α-актинин выявлялся в виде радиальных штрихов, отходящих от АК и превосходивших по длине.




Рис. 3. Аккумуляция зиксина при формировании АК нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR. Флажками обозначены формирующиеся АК, стрелками – ассоциированные с ними зоны аккумуляции зиксина.

Таким образом, различия АК нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток проявляются уже на стадии их формирования. В настоящем исследовании показано, что общий для нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов этап аккумуляции Е-кадхерина в точечных агрегатах сменяется, в случае нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2, их латеральным расширением и формированием тангенциального АК, ассоциированного с периферическим актиновым пучком. Напротив, точечные АК трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1 удлиняются в радиальном направлении, одновременно с формированием прямых актиновых пучков, ассоциированных с ними. Можно предположить, что созревание начальных кадхерин-содержащих точечных кластеров в радиальные АК зависит от трёх событий: ассоциации адгезионной бляшки с актиновыми филаментами за счёт адаптерных белков, в частности, за счёт зиксина, формирования поперечных сшивок между этими филаментами посредством α-актинина и миозина II, что приводит к возникновению прямых актиновых пучков, и центростремительного миозин II-зависимого натяжения этих прямых актиновых пучков, приводящего к росту радиальных АК.


Похожий процесс описан для фокальных контактов. Формирование фокальных контактов зависит от натяжения актина-миозина. На начальных фокальных комплексах собираются стресс-фибриллы, натяжение которых обеспечивает рост фокального контакта и дальнейшую аккумуляцию актина-миозина, при этом передача натяжения от стресс-фибрилл к фокальным контактам осуществляется за счёт адаптерного белка зиксина (Hirata et al., 2008).


Рис. 4. Аккумуляция α-актинина при формировании АК трансформированных эпителиоцитов IAR-6-1. Флажком обозначен формирующийся АК, стрелкой – ассоциированная с ним зона аккумуляции α-актинина.


Существуют данные (Sperry et al., 2010), свидетельствующие о том, что активность зиксина при ЭМП играет важную роль в частичном сохранении межклеточной адгезии, лежащем в основе коллективной клеточной миграции. Недавние исследования (le Duc et al., 2010) дают основания говорить об АК как о своеобразных механосенсорах, рост которых зависит от актин-миозиновой контрактильности. При этом важную роль играет винкулин, взаимодействующий с β-катенином (Peng et al., 2010) и необходимый для конвертации механического натяжения в усиление адгезии. Локальное равновесие между миозин II-зависимыми силами натяжения, адгезионными взаимодействиями с соседними клетками и натяжением в направлении образования ламеллиподии обеспечивает рост и усиление адгезии.


3. Регуляция формирования АК нетрансформированных и трансформированных эпителиальных клеток малыми ГТФазами семейства Rho.

3.1. Влияние введения C3 трансферазы на формирование различных типов АК.

Для выяснения закономерностей формирования различных типов АК и механизмов перестройки тангенциальных эпителиальных АК в радиальные при неопластической трансформации была исследована роль малых ГТФаз семейства Rho (Rho и Rac) в регуляции межклеточной адгезии. АК трансформированных эпителиоцитов по форме были похожи на радиальные АК фибробластов. При сравнении влияния ингибирования Rho или Rac на тангенциальные АК нетрансформированных эпителиальных клеток IAR-2 и радиальные АК трансформированных эпителиальных клеток IAR-6-1 было принято решение исследовать в дальнейших экспериментах также и фибробласты линии Rat-1.


Для исследования влияния ингибирования ГТФаз Rho на формирование АК нами был разработан метод загрузки белков в клетки во время ранения монослоя. При изучении роли ГТФазы Rho мы использовали C3 трансферазу, инактивирующую Rho. Ранение клеточного монослоя инъекционной иглой в присутствии C3 трансферазы и флуоресцентного декстрана (в качестве маркера) приводило к загрузке ~50% клеток на краю раны. Контрольные эксперименты показали, что флуоресцентный декстран сам по себе не влиял на скорость схождения раны или аккумуляцию белков адгезии в межклеточных контактах. Введение C3 трансферазы в клетки культуры приводило к замедлению схождения раны до 7-8 ч (против 3-4 ч в контроле). После фиксации клетки окрашивали на F-актин или на кадхерин. Актиновые пучки в клетках, загруженных C3 трансферазой, были разрушены. Наличие C3 трансферазы в клетках IAR-2 препятствовало формированию тангенциальных АК эпителиоцитов IAR-2, E-кадхерин не аккумулировался на границах между клетками (рис. 5).

Трансформированные клетки IAR-6-1, загруженные C3 трансферазой, также не формировали радиальные АК. E-кадхерин при этом собирался исключительно в точечные кластеры. Аналогичные точечные кластеры, состоявшие из N-кадхерина, были видны в местах контакта между фибробластами Rat-1, загруженными C3 трансферазой. Эти клетки были неспособны формировать радиальные АК. Таким образом, активность Rho требуется для формирования как тангенциальных, так и радиальных АК.




следующая страница >>