shkolageo.ru 1 2 3 4


На правах рукописи


Ломакина Мария Евгеньевна


ИЗМЕНЕНИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА И ДИНАМИКИ КЛЕТОЧНОГО КРАЯ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ХАРАКТЕР КЛЕТОЧНОЙ МИГРАЦИИ ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ


14.01.12 – Онкология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


МОСКВА

2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н. Блохина РАМН (директор – академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов).


Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Александрова Антонина Юрьевна


Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Смирнова Елена Александровна


Доктор медицинских наук Штиль Александр Альбертович


Ведущая организация:

Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова


Защита диссертации состоится « 17 » ___июня___ 2011 года в ____ часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02) РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.


Автореферат разослан « » ____________ 2011 года.


Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы

Способность клеток опухоли к инвазии и метастазированию является одной из основных причин смертности людей, страдающих от онкологических заболеваний. Приобретение клеткой такого рода способностей является следствием того, что в процессе трансформации и опухолевой прогрессии нарушаются не только механизмы нормальной пролиферации клеток, но и их локомоторная активность. Изучение механизмов подвижности клетки и их нарушений в результате трансформации является одной из важнейших задач современной клеточной биологии.


На клеточном уровне основой возникновения этих свойств являются генетические изменения, приводящие к нарушению регуляции адгезии и подвижности клеток (Yamazaki et al., 2005). Установлено, что в этих процессах определяющую роль играют перестройки цитоскелетных структур.

Трансформированные клетки существенно отличаются от нормальных по своей морфологии и организации цитоскелета (Bershadsky and Vasiliev, 1988; Vasiliev and Gelfand, 1981; Mani et al, 2008; Polyak and Weinberg, 2009). Изменения цитоскелета имеют большое значение для развития фенотипа трансформированных клеток с инвазивным поведением. В частности, для многих типов трансформированных клеток описана редукция стресс-фибрилл, сопряженная с нарушением созревания контактных структур (Qui, 1997; Ровенский и Васильев, 2004). Такая организация цитоскелета часто коррелирует с повышением локомоторной активности и/или метастатического потенциала опухолевых клеток (Pokorna et al., 1994, Sachai and Marshall, 2003).

Однако вопрос о том, каким образом описанные цитоскелетные перестройки приводят к изменению характера клеточного движения, и какие именно изменения являются определяющими в приобретении клеткой инвазивного фенотипа остается неизвестным.

Хорошей моделью для исследования механизмов клеточного движения и анализа реорганизаций цитоскелета, определяющих форму клеток и характер миграции в норме и при неопластической трансформации является исследование миграции фибробластов. Фибробласты - один из основных морфологических типов клеток, характеризующийся высокой подвижностью.

Для фибробластов характерен мезенхимальный способ передвижения. Это движение одиночных клеток, при котором инициальным шагом является формирование так называемого ведущего края клетки, где происходит выбрасывание отростков и образование контактов с внеклеточным матриксом. В недавних исследованиях было показано, что ведущий край клетки во многом определяет характер и направленность ее движения. Так повышение уровня активности малой ГТФазы Rac приводит к появлению дополнительных участков псевдоподиальной активности у движущихся клеток и усилению их ненаправленной миграции (Pankov et al., 2005). Строение и характер формирования ведущего края клетки при трансформации изучены слабо. Исследование изменений, происходящих в строении цитоскелета и динамике ведущего края при трансформации бесспорно позволит лучше понять механизмы инвазии и метастазирования.



Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является исследование изменений в распределении и динамике псевдоподиальной активности, возникающих у движущихся фибробластов в результате неопластической трансформации; выявление особенностей ультраструктуры актинового цитоскелета трансформированных клеток, и анализ связи этих изменений с приобретением клеткой инвазивного фенотипа.


В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Описать характер распределения псевдоподиальной активности и динамику активного края у нормальных и трансформированных фибробластов.

2. Проанализировать изменения актинового цитоскелета и адгезионных структур у фибробластов с разной степенью трансформации. Особое внимание обратить на различия в ультраструктуре актинового цитоскелета активного края.

3. Оценить миграционную способность и описать характер движения трансформированных клеток на двумерном и трехмерном субстрате в сравнении с клетками контрольных линий.

4. Выявить какие из изменений цитоскелета, возникающие в результате трансформации, играют ключевую роль в приобретении клеткой способности к инвазии.


Научная новизна и практическая значимость работы

Необходимость исследований молекулярных и клеточных механизмов трансформации и приобретения опухолевыми клетками инвазивных способностей не подлежит сомнению.

Несмотря на огромный интерес к этой проблеме и достижения последних лет многие вопросы остаются неясными. В то время как довольно подробно исследованы перестройки цитоскелета на ведущем крае, лежащие в основе движения нормальных клеток, мало внимания до сих пор было уделено исследованию активного края трансформированных клеток. Изменения в строении цитоскелета, распределении и динамике клеточного края и регуляторные пути при развитии инвазивного фенотипа мало изучены. Отсутствуют работы, посвященные сравнительному анализу характера и динамики псевдоподиальной активности и локомоторного поведения трансформированных и нетрансформированных фибробластов.


Мы впервые в мире поставили перед собой задачу подробно оценить изменения динамики и распределения псевдоподиальной активности при трансформации и сопоставить их с изменениями, происходящими в ультраструктуре актинового цитоскелета ведущего края опухолевых клеток (которые также не были описаны ранее).

Поставленные вопросы очень важны и дают возможность более точно оценить вклад отдельных морфологических и динамических изменений, вызванных трансформацией, в формирование инвазивного клеточного фенотипа и выявить какие особенности цитоскелета трансформированных клеток лежат в основе этих изменений.

Реализация поставленных задач стала возможной благодаря использованию нами широкого спектра уникальных современных методов исследования, а именно: иммунофлуоресцентной, конфокальной и электронной микроскопии, прижизненного наблюдения за клетками при помощи дифференционно-интерференционного контраста (DIC), а также использования различных программ для статистической обработки полученных результатов.

Одной из поставленных задач, очень важных для понимания процессов инвазии, стало изучение локомоторного поведения трансформированных клеток. Вопросам регуляции движения опухолевых клеток уделяется много внимания, но в настоящее время большинство исследований проводится на молекулярном уровне с целой популяцией клеток. Мы впервые в мире поставили перед собой задачу комплексно оценить изменения цитоскелета, динамики и распределения активного края и характера миграции индивидуальных трансформированных клеток, т. е. определить взаимосвязь между всеми наблюдаемыми явлениями.

Еще одной особенностью нашей работы, является то, что мы использовали для исследования различные системы трансформации и изучали их параллельно, что дало возможность анализировать изменения, происходящие в клетках на разных стадиях неопластической трансформации. Во-первых, мы проводили свои исследования на модели моноонкогенной Ras-трансформации, которая позволяет оценить изменения, происходящие с клетками при мутации лишь одного конкретного гена, что очень удобно для понимания молекулярных механизмов этих изменений. Во-вторых, мы использовали модель SV40-трансформации, как пример вирусной трансформации, вызывающей более сложные генетические, а, как следствие, и морфологические изменения у клеток. И, наконец, в качестве третьей модели трансформации нами была использована опухолевая линия клеток фибросаркомы НТ-1080, которая замечательна в первую очередь тем, что проявляет способность к инвазии и является прекрасным примером «полноценно-измененных» опухолевых клеток. Параллельное исследование этих трех систем позволило нам сравнить все изменения, происходящие с клетками, при каждом из типов морфологической трансформации и выявить общие закономерности, характерные для неопластической трансформации в целом, а также проанализировать различия и оценить вклад каждого из выявленных признаков в формирование у клеток способности к инвазии.



Апробация работы

Диссертация апробирована на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, цитогенетики, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Материалы диссертационной работы были представлены на XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006); на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2008); на 13-й международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2009); на школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала (Санкт-Петербург, 2009); на международной школе-конференции “Cell Shape Changes: Cell Motility and Morphogenesis” (France, Paris, 2009); на международной конференции “Cellular Morphogenesis: Actin Cytoskeleton and Membrane Remodeling” (France, Gif-sur-Yvette); и на международном симпозиуме “Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies” (Пущино, 2010).


Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.


Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 145 страницах, содержит 42 рисунка и 25 таблиц и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», который включает 241 цитируемый источник.


ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры

В работе использовали три клеточные системы:

(1) Система Ras-трансформации включала клетки линий 10(3), являющиеся иммортализованными мышиными фибробластами (Harvey, Levine, 1991), и их трансформированные производные 10(3)RAS, полученные путем трансфекции исходной линии 10(3) плазмидой с геном конститутивно активного белка N-RASasp13 (любезно предоставлены П.Б. Копниным). (2) Система SV40-трансформации включала нетрансформированные клетки линий MRC-5 являющиеся эмбриональными легочными фибробластами человека (Jacobs et al., 1970) и их производные - трансформированные клетки MRC-5V1 и MRC-5V2, полученные путем заражения исходной линии MRC-5 вирусом SV40 (Simian Virus 40) (Huschtscha and Holliday, 1983). (3) Третья система включала подкожные фибробласты человека 1036 (любезно предоставленные А.А. Мининым, Институт Белка, РАН) и широко используемую исследователями линию фибросаркомы человека НТ-1080 (Rasheed et al., 1974; Deryugina et al, 1997; Strongin et al., 1993).


Клетки культивировали в среде DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Sigma, США) с добавлением 10% FCS (Fetal Calf’s Serum, PPA Laboratories, Австрия) и антибиотиков (по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина) при температуре 37С во влажной атмосфере в присутствии 5% СО2.


Иммуноблоттинг

Для выявления экспрессии белка Ras применяли метод иммуноблоттинга. Клетки предварительно лизировали при помощи буфера RIPA (RadioImmuno Precipitation Assay Buffer) (100 мкл на чашку Петри диаметром 6 см), содержащего ингибиторы протеаз, и центрифугировали при 10000g (4°С). Концентрацию белка в лизате определяли при помощи системы белкового анализа Bio-Rad Laboratories, США. Затем проводили электрофоретическое разделение белков в 15%-ном полиакриламидном геле с последующим переносом белка на мембрану (Amersham Biosciences, Великобритания).

Для окраски в качестве первых антител использовали моноклональные мышиные антитела pan-ras (Cell Signalling, Великобритания) и моноклональные кроличьи антитела к γ-тубулину GTU-88 (Sigma, США) и вторые антимышиные (Upstate, США) и антикроличьи (Upstate, США) антитела, конъюгированные с пероксидазой.

Проявление производили при помощи растворов Determinit ECL Advance Western Blotting Detection Kit (Amersham Biosciences, Великобритания): Sol A – Lumigen TMA-6 и Sol B - Lumigen TMA-6 (1:1).


Флуоресцентное окрашивание и микроскопия

Для иммунофлуоресцентного окрашивания цитоскелетных структур применяли фиксацию 3,7% раствором PFA на бессывороточной среде DMEM. Для окрашивания F-актина применяли флуоресцентный краситель Alexa Fluor 488 phalloidin (Molecular Probes, США); для окрашивания фокальных контактов в качестве I антител использовали моноклональные антитела: anti-Vinculin hVIN-1 (Sigma, США) и моноклональные антитела: anti-zyxin 164D (Transduction Lab.); для окрашивания миозина II – поликлональные антитела: anti-myosin (non-muscle) BT561 (Biomedical Technologies Inc.); для окрашивания р34 субъединицы Arp2/3 комплекса (Actin-related protein 2/3 complex) – поликлональные антитела anti-p34-Arc/ARPC2 (Upstate, США). В качестве II антител при окраске на белки фокальных контактов использовали антимышиные антитела, меченные родамином (TRITC-anti-mouse, Sigma, США), а при окраске на миозин и р34 использовали антикроличьи антитела, меченные родамином (TRITC-anti-rabbit IgG (H+L), Jackson Immuno Research, Великобритания). Окрашивание ядер производили флуоресцентным красителем DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Sigma, США).


Препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan (Zeiss, Германия) c объективами Plan-Neofluolar ×100 и ×40. Микрофотосъемку препаратов осуществляли с использованием цифровой камеры Olympus DP70 с программным обеспечением (DP Controller).


Прижизненное наблюдение и видеосъемка

Видеосъемку препаратов осуществляли в камере для прижизненного наблюдения при температуре 34°С на микроскопах Axioplan (Zeiss, Германия) с объективами Plan-Neofluar ×40 и ×25 и Nikon Eclipse-Ti объективом Plan-Neofluar ×40 (NA1.3) с использованием метода дифференционно-интерференционного контраста (DIC) при помощи цифровых камер Hamamatsu (Mode C8484-05G) и ORCA-ER Hamamatsu и с программным обеспечением Wasabi (Hamamatsu, Япония). Для последующей оценки распределения активного края производилась съемка клеток в режиме Time-Lapse общей продолжительностью 2 минуты с интервалом 4 секунды с увеличением объектива ×25 (в случае MRC-5, 1036) и ×40 (в случае 10(3), 10(3)RAS, MRC-5V1, MRC-5V2 и HT-1080). Для описания характера псевдоподиальной активности производилась съемка ведущего края клеток в режиме Time-Lapse общей продолжительностью 8-10 минут с интервалом 1 секунда с увеличением объектива ×40 и дополнительным увеличением ×2 (в случае SV40-трансформации).



следующая страница >>