shkolageo.ru   1 2 3 4

Анализ характера псевдоподиальной активности

Для анализа характера псевдоподиальной активности на активном крае клетки были использованы кимограммы (диаграмма, показывающая смещение отдельной точки вдоль заданной линии в течение заданного времени) (Hinz et al, 1999; Bear et al, 2002), построенные при помощи программы Image J. Для обработки были взяты 8-10-минутные кадровые последовательности видеосъемки клеток (с межкадровым интервалом равным 1 с) для каждой из исследуемых линий. В нашем случае, кимограмма иллюстрирует смещение отдельной точки активного клеточного края, вдоль линии, проведенной перпендикулярно клеточному краю, на протяжении 8-10 минут нашего наблюдения. Это позволило нам определить величину появляющейся на краю протрузии и ретракции, частоту смены протрузии на ретракцию, их скорости, частоту раффлов клеточной мембраны, «паузы» между протрузией и ретракцией.


Морфометрический анализ клеточной формы

Путем анализа контуров отдельно взятых клеток в программе Simple PCI были измерены площадь и периметр клеток, а также проанализировано распределение различных форм краевой активности. Для этого использовали 2-минутные кадровые последовательности. На основании оценки псевдоподиальной активности были выделены активные, слабо-активные, ретрактирующие и стабильные участки края и измерены их количество и протяженность. Мы проанализировали распределение разных форм краевой активности у нормальных и трансформированных клеток и статистически обработали полученные результаты


Исследование клеточной миграции

Мы анализировали миграцию клеток тремя способами.

(1) Анализировали характер и направленность миграции одиночных клеток на двумерном субстрате. Для этого клетки (около 30 клеток для каждой из линий) в редкой культуре на вторые сутки после посадки на размеченные покровные стекла (Bellco Biotechnology, США) фотографировали с интервалом в 2 часа в течение 8 часов. Съемка производилась на инвертированном микроскопе Axiovert 200 (Zeiss, Германия) при помощи камеры Axio Cam MRc (Zeiss, Германия) c увеличением объектива ×10. Позицию клетки определяли по положению ядра. При помощи программы Simple PCI измеряли общий путь, а также расстояние от начальной до конечной точки движения– прямолинейное (эффективное) движение (D). Направленность миграции оценивали как отношение D/T.


(2)Анализировали миграцию клеток в экспериментальную рану (Valster et al., 2005). Клетки высаживались на размеченные покровные стекла (Bellco Biotechnology, США) (24×24 мм), доращивались до монослоя и удаляли часть монослоя с помощью бритвы. Фотографировали три участка раны с каждого стекла (опыта) сразу после нанесения раны и после 24-часовой инкубации. Съемка производилась на инвертированном микроскопе Axiovert 200 (Zeiss, Германия) при помощи камеры AxioCam MRc (Zeiss, Германия) c увеличением объектива ×10. Количественная оценка миграции клеток в рану осуществлялась путем подсчета ядер клеток, вышедших в рану за сутки на участке длиной 1000 мкм. Кроме того, измерялись расстояния выползания клеток за это время.

(3) Для анализа трехмерной миграции исследуемых культур применялись камеры Бойдена с фильтрами, которые имели диаметр пор 8 нм (BD Falcon), а для оценки инвазии использовали камеры с фильтрами дополнительно покрытыми матригелем (BD Falcon).Для этого клетки высевали в камеры в количестве 5х104 кл/мл для MRC-5, MRC-5V1, MRC-5V2, 1036 и НТ-1080 и 105 кл/мл для 10(3) и 10(3)RAS в среде DMEM с добавлением 5% FCS. В качестве хемоаттрактанта использовали среду DMEM с добавлением 10% FCS. Камеры культивировали в течение 10,12,20 часов при температуре 37С во влажной атмосфере в присутствии 5% СО2. Затем клетки фиксировали холодным метанолом при температуре -20С и окрашивали флуоресцентным красителем DAPI и исследовали при помощи флуоресцентного микроскопа Axioplan (Zeiss, Германия) c объективом Plan-Neofluolar ×20. Съемку препаратов осуществляли с использованием цифровой камеры Olympus DP70 (Olympus, Япония) с программным обеспечением DP Controller (Olympus, Япония). Затем подсчитывали количество клеток (по количеству ядер), выползших на внешнюю сторону фильтра в 10-15 полях зрения. Кроме того, определяли % инвазии (INV) и индекс инвазивности (I),рассчитываемые по формулам приведенным в методическом пособии.



Конфокальная микроскопия

Для более подробного исследования строения актинового цитоскелета часть иммунофлуоресцентно окрашенных препаратов снимали на конфокальном микроскопе (Zeiss, Германия) с увеличением объектива Plan-Neofluar ×100. Полученные Z-серии обрабатывались при помощи программы Image Examiner, в результате чего были получены Z-сечения клеток и измерена средняя толщина ламеллы и средняя толщина раффла.


Платиновые реплики и электронная микроскопия

Элетронная микроскопия платиновых реплик применялась нами для тонкого строения актинового цитоскелета на электронно-микроскопическом уровне. Метод получения платиновых реплик с цитоскелетных препаратов включал в себя следующие этапы обработки культивируемых клеток: экстракция, фиксация, высушивание методом перехода критической точки, напыление, отмывка реплик (подробно см. Svitkina and Borisy, 1998; Svitkina, 2007). Платиновые реплики цитоскелета исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 1200EX (JEOL, Япония) и CCD камеры ORIUS 835.10W (Gatan) с программным обеспечением Gatan Digital Micrograph. Изображения представляли в инвертированном виде.


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изменение морфологии и актинового цитоскелета у фибробластов при трансформации

Контрольные фибробласты всех трех исследованных линий (10(3), MRC-5 и 1036) в редкой культуре - хорошо распластанные и поляризованные, плоские клетки. Они имеют хорошие контакты с субстратом, к которым подходят крупные акто-миозиновые пучки. Имеется развитая система микротрубочек. Активный край, как правило, сосредоточен в передней (ведущей) части клетки и представлен 1-2 тонкими широкими ламеллами. (рис. 1 и 2)

Морфология всех исследованных трансформированных клеток существенно изменена. Общим является значительное уменьшение площади клеток, редукция актиновых пучков, снижение числа и размера фокальных контактов (рис. 1). Все эти изменения являются типичными для неопластической трансформации и описаны многими авторами (Vasiliev and Gelfand, 1980; Минина и др., 2003; Young et al., 2003; Vasiljev, 2004; Shutova et al., 2008), что доказывает, что в нашем случае клетки действительно претерпели морфологическую трансформацию.




Рис. 1. Организация актинового цитоскелета и фокальных контактов контрольных и трансформированных фибробластов. У контрольных клеток хорошо видны мощные актиновые пучки (отмечены тонкими стрелками) и крупные штриховые фокальные контакты (отмечены толстыми стрелками), отсутствующие у трансформированных клеток. Окрашивание актина фаллоидином, коньюгированным с ФИТЦ (зеленый) и фокальных контактов антителами к винкулину (красный).

Было установлено, что использованные нами трансформированные клетки несколько отличаются между собой по степени изменения морфологии и актинового цитоскелета. Моноонкогенная Ras-трансформация может рассматриваться, как промежуточный этап на пути к приобретению клеткой инвазивного фенотипа, и наблюдаемые нами приобретенные нарушения выражены у 10(3)RAS клеток несколько слабее, чем у других, рассмотренных нами трансформированных линий. Форма клеток данной культуры изменилась: по нашим данным площадь трансформированных фибробластов уменьшилась в 1,6-раза по сравнению с контролем, возросла дисперсия и элонгация (по данным ранее полученным в нашей лаборатории (Минина и др., 2002), актиновые пучки и фокальные контакты существенно редуцированы, но все же у многих клеток сохраняются остаточные актиновые пучки. Т.е. это начальный этап морфологических изменений. SV40-трансформированные клетки культур MRC-5V1 (в меньшей степени) и MRC-5V2 (в большей степени) по многим исследованным признакам приближаются по своим характеристикам к инвазивному фенотипу клеток фибросаркомы HT-1080 и могут рассматриваться как клетки с большей степенью морфологической трансформации. Так клетки MRC-5V2 как и клетки НТ-1080 практически теряют поляризацию и у многих клеток полностью отсутствуют актиновые пучки и остаются лишь точечные фокальные комплексы (рис. 1).

2. Перераспределение и реорганизация псевдоподиальной активности в результате трансформации


Прижизненное наблюдение и окрашивание фиксированных клеток антителами к Arp2/3-комплексу позволило нам выявить существенные различия в распределении различных форм края (стабильного, сильно- и слабо-активного, ретрактирующего) по периметру.

Контрольные клетки представляют собой "классические фибробласты". Они хорошо поляризованы и имеют четко различимые активные и стабильные края. Общая длина нестабильного края у контрольных клеток всех линий составила 44-55% от всего клеточного периметра. Большая часть его представлена сильноактивными участками (САУ), и лишь небольшая слабоактивными (СлАУ), которых вовсе нет у мышиных фибробластов 10(3). У них имеется довольно крупный сильноактивный участок края (САУ) на переднем (ведущем) конце клетки. Боковые части клетки и хвостовая часть, как правило, представляют собой ярко-контрастирующие стабильные участки (СтУ), которые занимают 45-56% перимерта. Небольшие дополнительные участки активности (как правило, ретрактирующие участки (РУ) (2-9% периметра), но иногда и САУ) могут встречаться в дистальной части хвоста (рис. 2А).

Таким образом, у самых разных фибробластов стабильный край занимал около 50% клеточного периметра и, вероятно, это может являться характерной чертой нормальных клеток.

Мы показали, что трансформация клеток приводит к увеличению доли активного края перераспределению активности вдоль периметра клетки и, как крайнее проявление, частичной утрате ярко выраженной полярности клетки. Так, у менее измененных клеток культур 10(3)RAS и MRC-5V1 поляризация сохраняется, а у 10(3)RAS даже увеличивается: часто имеется довольно крупный участок сильной активности (САУ) на переднем конце клетки, но, кроме того, встречаются довольно крупные участки активности на хвосте и на боковых поверхностях клетки (рис. 2) У более трансформированных MRC-5V2 и у клеток фибросаркомы НТ-1080 утрата поляризации более заметна: у части клеток сильно активный край занимает большую часть периметра, а у части разделен на несколько практически равноценных САУ, что затрудняет визуальное определение ведущего края (рис. 2).



Кроме того, у некоторых трансформированных клеток (что особенно выражено при SV40-трансформации) появляется довольно ярко выраженный слабоактивный край (СлАУ), который как бы заменяет стабильный. СлАУ представлены мелкими ламеллиподиями и филоподиями, кромка которых, как и кромка САУ, окрашивается антителами к Arp2/3-комплексу. Это позволяет нам считать эти участки активными, так как позитивная окраска антителами к Arp2/3-комплексу указывает на то, что там происходит Arp2/3-зависимая полимеризация актина.

Одним из факторов, стабилизирующих боковой край мигрирующих клеток, может быть наличие актиновых стресс-фибрилл, натянутых вдоль стабильного края клетки. Показано, что у клеток, обработанных ингибиторами акто- миозинового сокращения (Y27632 или блеббистатином), у которых разрушены стресс-фибриллы, количество псевдоподий на боковых краях существенно возрастает (Shutova et al., 2008). В случае трансформированных клеток количество и размер стресс-фибрилл значительно редуцированы, что может приводить к ослаблению стабилизации боковых краев клетки.

Общим для трансформированных клеток всех исследованных линий является то, что доля нестабильного края у них значительно возрастает. И если у Ras-трансформированных клеток доля нестабильного края увеличилась лишь до 65% (в 1,5 раза), то у SV40-трансформиованных клеток и у клеток фибросаркомы доля активного края увеличилась еще больше и составила 86-87% и 92% соответственно. Таким образом, при увеличении степени трансформации возрастала и доля активного края. Соответственно, отмечалось существенное снижение доли стабильного края (в 1,6–7 раз в зависимости от клеточной линии), вплоть до 8% клеточного периметра у клеток фибросаркомы. Возрастание общей доли нестабильного края происходит, в основном, за счет увеличения доли его сильно-активной составляющей и небольшого увеличения СлАУ у MRC5-V1 и MRC-5V2 клеток; ретракции не имеют четких тенденций к убыванию или возрастанию и их изменения могут не рассматриваться, как серьезные. Хотелось бы отметить, что наибольший процент СлАУ отмечен у менее измененных клеток «переходной» в плане морфологической трансформации линии MRC-5V1, у MRC-5V2 процент несколько снижается и приближается к контрольному значению, а у НТ-1080 процент СлАУ даже немного меньше контрольного. Это может свидетельствовать о возможности вновь появившихся СлАУ впоследствии увеличивать свою активность и превращаться в САУ, что и происходит у более трансформированных MRC-5V2. Таким образом, СлАУ можно охарактеризовать как переходную от стабильного к активному состоянию форму края. Следует также отметить, что при более длительном наблюдении (до 40 минут) у трансформированных клеток наблюдалась слабая активность на «стабильных участках» или они и вовсе сменялись сильно-активными участками, в то время как у контрольных клеток этого не происходило. Т.е., полученные нами данные по снижению доли стабильного края у трансформированных клеток могут быть несколько занижены из-за ограниченного времени наблюдения, и вполне вероятно, что не стоит говорить о наличии «истинно стабильного» края у трансформированных клеток. В то же время, у контрольных клеток стабильные края оставались таковыми даже при длительном наблюдении, а процесс смены местоположения ведущей ламеллы занимал гораздо большее время и чаще всего осуществлялся под давлением внешних факторов (например, контактов с соседней клеткой).


Столь существенное увеличение активного края и редукция стабильных участков края у трансформированных клеток, скорее всего, связана с увеличением количества активного Rac, вызывающего WASP-опосредованную, Arp2/3-зависимую полимеризацию актиновой сети. Скорее всего, перераспределение активного края (существенное увеличение активного края и редукция стабильных



Рис. 2. Распределение псевдоподиальной активности по периметру клеток исследуемых культур. А. Изображения клеток исследуемых культур, снятые в режиме DIC. У клеток контрольных линий видны стабильные (СтУ) и активные (АУ) участки края (отмечены на примере клетки 10(3)). У трансформированных клеток видны многочисленные активные участки края (отмечены белыми стрелками), в том числе слабо-активные участки (отмечены прерывистыми стрелками на примере клетки MRC-5V1. На примере клетки MRC-5V2показаны участки реткакции (РУ) (отмеченные черными стрелками, представленные у данной клетки в виде ретракционных фибрилл. Б. Диаграммы, иллюстрирующие распределение псевдоподиальной активности у клеток исследуемых культур.

участков) и частичная утрата клеточной поляризации происходит благодаря изменению баланса малых ГТФаз. В случае SV40-трансформации это связано с экспрессией ST вируса. ST способен вызывать повышение активного Rac и Cdc42 (Nunbhakdi-Craug et al., 2003), что может обуславливать появление дополнительных участков Arp2/3-зависимой полимеризации актина (участков активности) и, в частности, появление дополнительных Cdc42-индуцированных филоподий в составе СлАУ у исследуемых клеток. Кроме того, для всех исследованных линий было установлено увеличение уровня экспрессии Ras (рис. 3), который, также приводит к увеличению активного Rac (Bag-Zagi and Hall, 2000; Lambert et al., 2002; Reparsky et al., 2004; Strumane et al., 2006). Помимо этого, показано, что усиленная экспрессия N-RAS приводит к увеличению количества дефосфорилированного кофилина (Chan et al., 2000; DesMarais et al., 2005, Alexandrova et al., 2006), который в свою очередь может разрезать актиновые филаменты в составе краевых пучков, высвобождая свободные плюс-концы, стимулируя, таким образом, полимеризацию новых филаментов, приводящая к образованию новых протрузий.





Рис. 3. Анализ экспрессии Ras в клетках исследуемых культур.

Окрашивание антителами panRas (p21) и GTU88 (к γ-тубулину, р48). Наблюдается повышенная экспрессия Ras в клетках всех трансформированных линий.



<< предыдущая страница   следующая страница >>