shkolageo.ru 1 2 3



На правах рукописи


Фёдорова Ирина Александровна


ХАРАКТЕР ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫХ

УЧАСТКОВ И КОМПАКТНОСТИ ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ CHIRONOMUS (DIPTERA) ПОД ВЛИЯНИЕМ ХОЛИНОТРОПНЫХ

ПРЕПАРАТОВ


03.00. 25 – гистология, цитология, клеточная биология


Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Астрахань - 2009 г.


Работа выполнена на кафедре общей биологии, фармакогнозии и ботаники

Саратовского государственного медицинского университета

им. В.И. Разумовского


Научный руководитель:


доктор биологических наук, доцент Полуконова Наталья Владимировна


Официальные оппоненты:


доктор биологических наук, с. н. с. Воронежская Елена Евгеньевна


доктор биологических наук, профессор   Фельдман Бронислав Владимирович


Ведущая организация: Институт биологии внутренних вод РАН

им. И. Д. Папанина


Защита состоится «27» ноября 2009 г. в 1200 часов
на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1. ЕИ АГУ.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета


Автореферат разослан «27» октября 2009 г.





Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Нестеров Ю.В.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Холинотропные препараты - пилокарпин и атропин – алкалоиды с противоположным действием на вегетативную нервную систему и секрецию слюнных и других желёз: м-холиномиметик (пилокарпин) стимулирует секреторную деятельность, м-холиноблокатор (атропин) - угнетает (Levin, 1992; Busch, Borda, 2007). Изучение действия нейротропных веществ (лекарственных препаратов, фосфорорганических и карбаматных соединений, используемых в качестве пестицидов и боевых отравляющих веществ антихолинэстеразного действия), воздействующих на мускариновые холинореактивные системы, актуально в связи с их широким применением в медицине, военной промышленности и сельском хозяйстве (Нежинская и др., 2008 а и др.).


Индикатором воздействия на субклеточном уровне служат изменения в интерфазных ядрах клеток человека и животных (Тимошевский, Назаренко, 2005). Уникальный модельный объект для анализа изменений функциональной активности интерфазных хромосом представляют политенные хромосомы (ПХ) клеток слюнных желез личинок двукрылых насекомых, постоянно находящиеся в интерфазном состоянии (Кикнадзе и др., 1996). Наличие м-холинергической нейромедиации у Chironomidae (Beauvais et al., 1999; Turberg et al., 1999) делает ПХ их слюнных желез, высокочувствительных к воздействию холинотропных препаратов, моделью для выявления их цитогенетических эффектов, а личинок - тест-системой для оценки действия этих препаратов на организменном, клеточном и субклеточном уровнях. Сведения о влиянии холинотропных препаратов на функциональную активность ПХ клеток слюнных желёз хирономид разрозненны, хотя цитогенетические эффекты пилокарпина изучались, начиная с 60-70-х годов (Clever, 1969; Beerman, 1973). Установлено, что под действием пилокарпина белковый секрет из слюнной железы полностью выводился (Mähr et al., 1980), введение атропина в организм личинок, наоборот, сопровождалось уменьшением секреции (Grossbach, 1977). Цитогенетические эффекты пилокарпина и атропина на ПХ хирономид не сравнивали.

Существенными недостатками подавляющего большинства проводимых ранее исследований цитогенетических эффектов лекарственных препаратов на ПХ Chironomus были визуальная или с ограниченным использованием морфометрических показателей оценка изменений активности ПХ, часто без статистической обработки результатов, и отсутствие единых стандартных подходов к условиям проведения эксперимента, что препятствовало сопоставлению данных разных авторов. Не была известна индивидуальная реакция особей на основе естественного генетического полиморфизма, не установлено - обратимы или необратимы изменения активности функционально значимых участков ПХ под действием заведомо токсических концентраций. Между тем, сравнительный анализ отклика ПХ под влиянием холинотропных препаратов на основе использования современной обработки данных позволит не только оценить ответную реакцию ядерного аппарата на их воздействие, расширив представления о функционировании интерфазных хромосом в целом, но и усовершенствовать методические подходы к анализу цитогенетических эффектов лекарственных средств.


Цель исследования: установить характер и степень воздействия холинотропных препаратов на функционирование политенных хромосом слюнных желез личинок Chironomus plumosus in vivo в остром эксперименте.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать методические подходы к оценке действия лекарственных препаратов на основе анализа их цитогенетических эффектов, выявить особенности функциональной активности ПХ клеток слюнных желёз личинок Ch. plumosus при акклимации к лабораторным условиям и установить границы изменчивости и процент работающих активных участков ПХ в контроле.

2. Установить особенности влияния холинотропных препаратов на личинок с различными генотипическими характеристиками.

3. Изучить динамику работы функциональных участков ПХ и сравнить цитогенетические эффекты холинотропных препаратов в остром периоде.

4. Проанализировать цитогенетические эффекты холинотропных препаратов с противоположным действием на секрецию при их комбинированном влиянии.

5. Оценить обратимость изменения активности функционально значимых участков ПХ под воздействием заведомо токсической концентрации пилокарпина.

Научная новизна. Впервые на уровне функционирования интерфазных хромосом доказано доминирование м-холиноблокатора - атропина по сравнению с агонистом - пилокарпином, известное ранее на уровне функционирования м-холинорецепторов, что, наряду с универсальностью холинергической нейромедиации у эукариотических организмов, позволяет эффективнее использовать возможности холинергических структур разных уровней организации и прогнозировать ответную реакцию ядерного аппарата на воздействие холинотропных веществ. Расширены представления о функционировании интерфазных хромосом: впервые показано, что неоднородность в активности функционально значимых участков ПХ между группами особей с разными генотипическими характеристиками, проявляющаяся в период акклимации личинок, существенно снижена под воздействием токсиканта, на примере действия холинотропных препаратов.


Теоретическая и практическая значимость работы. Установлено, что уровень активности специфических участков ПХ зависит от числа гетерозиготных инверсий в кариотипе (активность BR2G уменьшалась с увеличением числа инверсий в кариотипе от 1.88 при одной инверсии до 1.59 при трех.), что свидетельствует о работе генома как единой сбалансированной системы. При этом под воздействием токсикантов такая зависимость существенно снижена. Впервые показана динамика изменения функциональной активности ПХ Ch. plumosus под действием препаратов противоположного действия на секреторную активность. Установленные закономерности действия холинергических лигандов - антагонистов на секрецию желёз используются на спецкурсе по физиологической экологии животных кафедры физиологии человека и животных СГУ им. Н. Г Чернышевского.

Впервые представлены каталоги известных к настоящему времени пуфов de novo, как по данным ряда авторов, так и собственным для Ch. plumosus, что позволяет проводить мониторинг пуфинговой активности у этого вида.

Оптимизирована методика цитогенетического тестирования лекарственных препаратов на ПХ: впервые разработана десятибалльная шкала оценки морфофункциональных изменений личинок; рекомендовано изменение условий содержания личинок Chironomus в условиях острого эксперимента; доказано, что ведущим показателем служит активность NО. Обосновано отсутствие необходимости учета генотипических комбинаций в связи со снижением разброса значений функциональной активности ПХ в экспериментах на генотоксичность у особей с разными генотипическими характеристиками. Методические подходы по использованию личинок Chironomus как тест-системы в цитогенетических исследованиях внедрены в спецкурсы экологической генетики кафедры генетики и гидробиологии кафедры морфологии и экологии животных СГУ им. Н. Г Чернышевского.

Апробация работы. Результаты исследования апробированы на научно-практической конференции «Экологические проблемы урбанизированных территорий» (Елец, 2007 г.); XXI Любищевских чтениях «Современные проблемы эволюции» (Ульяновск, 2007 г.); Международной научной конференции (Астрахань, 2007 г.); XIII Международной школы-конференции молодых учёных «Биология внутренних вод» (Борок, 2007 г.); 9-ой конференции «Водные экосистемы, организмы, инновации – 9» (Москва, 2007 г.); III Всероссийской конференции по водной токсикологии (Борок, 2008 г.); Международной научно-практической конференции (Ставрополь, 2008 г.); научных конференциях аспирантов и молодых ученых (Саратов, СГМУ, 2007-2008 г.); Международной научной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009 г.).


Публикации. По теме диссертационного исследования опубликованы 14 работ, из них две – в реферируемых научных журналах списка ВАК; три находятся в печати.

Личный вклад автора включает проведение экспериментов, обработку данных и алгоритмическую реализацию разработанных подходов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Объём работы составляет 155 страниц, содержит 18 таблиц и 39 рисунков. Список литературы включает 194 источника, в том числе 83 на иностранном языке.

Положения, выносимые на защиту.

1. Ведущим показателем для оценки изменений функциональной активности ПХ служит реакция одного из универсальных компонентов ядра эукариотических клеток, ответственного за поддержание клеточного гомеостаза, - ядрышкового организатора (NO), который работает как в контроле, так и при воздействии в 97–100% клеток. На токсичность препарата указывает снижение интенсивности работы NO.

2. Доминирование атропина, известное ранее на уровне функционирования м-холинорецепторов, опосредованно проявляется и на уровне функционирования интерфазных хромосом: атропин и смесь атропина с пилокарпином дают одинаковый цитогенетический эффект подавления за счет препятствия атропином стимулирующего действия пилокарпина.

3. Функциональная активность интерфазных хромосом при акклимации личинок к лабораторным условиям неоднородна при разных генотипических характеристиках и является результатом включения в работу в разных клетках неодинакового числа активных участков ПХ.

4. При токсическом воздействии, на примере влияния холинотропных препаратов, неоднородность активности функционально значимых участков ПХ при разных генотипических характеристиках снижается.

5. Изменения активности функционально значимых участков ПХ, включая образование пуфов de novo, обратимы, что свидетельствует о модификационном характере её изменчивости.


Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю д. б. н. Н. В. Полуконовой, глубокоуважаемым коллегам, с которыми обсуждались фрагменты настоящего исследования – д.б.н. Н. А. Шобанову, д. б. н. Г. М. Чуйко, д. м. н. С. И. Богословской, д. б. н. С. И. Беляниной, к. м. н. Н. В. Петрову, к. ф.-м. н. К. Н. Дворецкому, С. Е. Дееву. Автор благодарен Е. Ю. Мельникову и М. С. Козлову за помощь в подготовке иллюстраций. Я глубоко благодарна своим родителям, без моральной и финансовой поддержки которых эта работа не могла бы быть осуществлена.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ АНАЛИЗА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ ДВУКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ (обзор литературы)

Представлен обзор данных о функционировании ПХ двукрылых насекомых в норме и при воздействии различных факторов. Приведены особенности действия холинотропных препаратов на живые системы.


Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал

В качестве испытуемого объекта использованы личинки Ch. plumosus из озера Сазанка Саратовской области, собранные в 1 декаде марта 2007 г. и 1 декаде февраля 2008 г. В эксперименте использовали личинок Ch. plumosus IV возраста 7 фазы зрелости (Ильинская, Иордан, 1975). Всего исследовано 1080 личинок, в т. ч. 100 – в опыте на акклимацию (50 - зафиксированных у проруби, 50 - акклимированных в течение суток) и 980 – в экспериментах по воздействию: 210 - в контроле, 250 – под воздействием атропина, 200 – пилокарпина; при комбинированном воздействии препаратов - 270, в опыте на обратимость – 50.

Методы

До начала экспериментов личинок акклимировали в течение суток, во время которых погибали травмированные при транспортировке особи. Эксперименты проводили в кюветах объемом - 250 мл, глубиной – 5 см и площадью поверхности – 102 см2, при комнатной температуре, в непроточных условиях, без субстрата (во избежание адсорбции препарата на поверхности частиц ила)**, в отстоянной водопроводной воде при pH=7 (РД 52.24.635-2002. Методические указания, 2002). Экспозиция препаратов - 12 - 96 ч соответствовала острому периоду воздействия, поэтому кормление животных не осуществляли. Состояние морфофункциональных изменений личинок под действием токсиканта оценивали по разработанной нами десятибалльной шкале (табл. 1).


LC50 для атропина и пилокарпина определяли пробит-анализом (Коросов, Калинкина, 2003) и аналитическим экспресс-методом (Фрумин, 1991). Препаративная форма веществ - атропина сульфат (ФГУП Московский эндокринный завод, Россия) и пилокарпина гидрохлорид (Ферейн, Россия).

Для фиксации личинок использована спирт-уксусная смесь (96% этанол, ледяная уксусная кислота, 3:1). Препараты ПХ готовили по этилоорсеиновой методике (Дёмин, 1989). Временные препараты ПХ анализировали под световым микроскопом «Люмипам» при увеличении 7×60.

Ch. plumosus, 2n=8, цитологический комплекс thummi: I(AB), II(CD), III(EF) и IV(G). Центромеры морфологически выражены. Гомологи ПХ IV не конъюгируют. Вид полиморфен за счет парацентрических инверсий и B-хромосом. В кариотипе пять активных районов. BR локализованы: одно в плече В ПХ I(АВ), по цитофотокарте Максимовой (1976), в 16 районе и два в плече G ПХ IV - в 7 и 8 отделах. NО – локализован в плече G отделе 2, пуф (PВ) – в плече В ПХ I (АВ) в 21 районе.

Изменения функциональной активности ПХ исследовали по индексам: компактности (CR***) - отношение абсолютной длины III хромосомы к ширине ее центромеры (Ильинская, 1989), ядрышкового организатора (NОR***) - отношение максимального диаметра к ширине интактного района 6 ПХ IV (Stockert, 1990), колец Бальбиани - BR1GR и BR2GR*** - отношение максимального диаметра, соответственно, BR1G и BR2G к ширине интактного района 6 ПХ IV (Лычёв, 1968), BRВ*** - отношение максимального диаметра BR плеча В к ширине интактного района 17 (Лычёв, 1968) и пуфа (PВR***) - отношение максимального диаметра пуфа к ширине интактного района 21 (Лычёв, 1968). Учитывали не отмеченные в контроле пуфы de novo. Их описание проводили по классификации Максимовой (1983), выделяющей пять классов пуфовой активности. Учитывали только пуфы IV – V классов, т.к. при работе со световым микроскопом малые пуфы практически неотличимы от междисков. Детальное картирование пуфов, инверсионных последовательностей дисков ПХ и обозначение последовательностей дисков проводили по Шобанову (1994 а, б).

Таблица 1

Шкала сопряженности токсического действия холинотропных препаратов

с морфофункциональными изменениями у личинок Ch. plumosus


Бал-лы

Динамика локомоторной активности и поведения экспериментальных личинок


Дыхательные движения

Ответ на раздражение пинцетом

Окраска и упругость тела

% погибших

Состоя-ние

1

Активные, на дне




Попытка свернуться в кольцо

Ярко-красная




0

норма

2

Снижение активности



Различ-ные стадии интоксикации

3

Медленные, на дне, единичные особи неподвижны

Красная


4

Медленные, на дне; 30% неподвижны

5

Медленные, на дне; 50% неподвижны

Темно-красная. Лизис тканей


6

Редкие движения на дне;большинство неподвижны


Темно-красная.

Лизис тканей

1-3

7

5-25

8

Судорожные сокращения подталкивателей

25-50

9

Неподвижны

Едва заметные судорожные сокращения подталкивателей

Темная.

Лизис тканей


50-90

10

Отсутствует

100

гибель


Определение степени компактности ПХ проводили по Ильинской (1989). В норме о функциональной активности ПХ свидетельствует изменение значений индекса компактности в пределах от 5.7±0.1 до 10.3±0.1; о снижении функциональной активности ПХ – как уменьшение значения до 4.6 ± 0.1, так и увеличение до 14.7±0.3 и выше.

При сравнении цитогенетических эффектов для нивелирования погрешностей (связанных со стрессовым воздействием на основе изменения температурных условий, отсутствия субстрата и пищи в период острого эксперимента) данные нормировались на контроль, т.е. значения индексов контроля принимались за единицу. Статистическую обработку проводили в среде специализированных пакетов Excel, Statistiсa 6. Для характеристики группы использовали среднее арифметическое и стандартное отклонение. Для оценки значимости различий использовали однофакторный дисперсионный анализ при Р < 0.05, для анализа различий дисперсий – Ф-тест Фишера.


Схема проведения акклимации. При исследовании влияния акклимации 50 личинок были зафиксированы у проруби сразу после вылова, 50 – через сутки после адаптации к лабораторным условиям.

Схема проведения эксперимента по влиянию атропина и пилокарпина. При анализе цитогенетических эффектов атропина использовали концентрации 0.1 мг/мл, 0.13 мг/мл, 0.2 мг/мл 0,4 мг/мл и 1 мг/мл при экспозицях - 12, 24, 48, 72 и 96 ч, - пилокарпина – 0.5 мг/мл, 0.67 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл и 5 мг/мл при экспозициях - 12, 24, 48, 72 ч, т.к. уже на 3 сут (72 ч) наблюдалась гибель личинок. Подбор концентраций проводили с учетом более сильного воздействия атропина, как блокатора м-холинорецепторов.

Схема проведения эксперимента по комбинированному влиянию холинотропных препаратов. Личинок помещали в четыре ёмкости: с чистой водой (контроль, раствор 1); в раствор атропина в концентрации 0.13 мг/мл (раствор 2) и 0.4 мг/мл (раствор 3); и - пилокарпина - 0.67 мг/мл (раствор 4); добавление к раствору атропина 0.13 мг/мл пилокарпина 0.67 мг/мл (5), перемещение из раствора атропина 0.4 мг/мл в пилокарпин 0.67 мг/мл (6), добавление к раствору атропина 0.4 мг/мл пилокарпина 0.67 мг/мл (7). Через 24 ч часть личинок оставалась в растворах 1–4; часть - из растворов 2 и 3 помещали в новую ёмкость с раствором 4; и часть - находилась в ёмкостях с растворами 2 и 3, к которым был добавлен раствор 4. Личинок фиксировали через 24, 48 и 72 ч, как после их перемещения из атропина в пилокарпин, так и при добавлении пилокарпина к атропину. Параллельно фиксировали контрольных личинок и личинок из растворов атропина и пилокарпина через 12, 24, 48, 72 и 96 ч. В эксперименте использовали концентрации атропина, составляющие 1/15 и 1/5 доли от LC50 и более высокую концентрацию пилокарпина – 1/3 LC50.

Схема проведения эксперимента на обратимость. Личинки были помещены в раствор пилокарпина 2 мг/мл. Через 12 ч после начала воздействия часть личинок оставалась в растворе пилокарпина, другая часть была перемещена в емкость с чистой водой. Личинок зафиксировали: 1) через 12 ч воздействия пилокарпином, 2) через 36 ч воздействия пилокарпином, 3) через 60 ч воздействия пилокарпином, 4) через 24 ч нахождения в воде (после 12 ч воздействия пилокарпином), 5) через 48 ч нахождения в воде (после 12 ч воздействия пилокарпином). Контроль устанавливался через 12, 36 и 60 ч. Во всех экспериментах при каждой экспозиции и концентрации исследовали по 10 личинок (по 10 клеток от каждой личинки).



Глава 3. СОСТОЯНИЕ АКТИВНЫХ РАЙОНОВ И КОМПАКТНОСТИ

ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ CHIRONOMUS PLUMOSUS

Активность функциональных участков ПХ и инверсионный полиморфизм

У личинок обнаружены следующие генотипические комбинации (табл. 2).


Таблица 2

Генотипические комбинации личинок Ch. рlumosus из озера Сазанка

№ № п/п

Генотипические комбинации


Частота встречаемости, % (от 760 особей)

1

А1.1 В1.1 С1.1 D4.4 Е1.1 F1.1 G1.1

6

2

А1.2 В1.1 С1.1 D4.4 Е1.1 F1.1 G1.1

2

3

А1.1 В1.2 С1.1 D4.4 Е1.1 F1.1 G1.1

10

4

А1.1 В1.1 С1.1 D1.4 Е1.1 F1.1 G1.1

10

5

А1.1 В2.2 С1.1 D4.4 Е1.1 F1.1 G1.1

2

6

А1.1 В1.2 С1.1 D4.4 Е1.1 F1.1 G1.1

2

7

А1.2 В1.2 С1.1 D4.4 Е1.1 F1.1 G1.1

10

8

А1.2 В1.1 С1.1 D1.4 Е1.1 F1.1 G1.1


12

9

А1.2 В1.1 С1.1 D4.4 Е1.2 F1.1 G1.1

2

10

А1.1 В2.2 С1.1 D1.4 Е1.1 F1.1 G1.1

2

11

А1.1 В1.2 С1.1 D1.4 Е1.1 F1.1 G1.1

10

12

А1.1 В1.2 С1.1 D4.4 Е1.2 F1.1 G1.1

2

13

А1.2 В2.2 С1.1 D1.4 Е1.1 F1.1 G1.1

2

14

А1.2 В1.2 С1.1 D1.4 Е1.1 F1.1 G1.1

12

15

А1.2 В1.1 С1.1 D1.4 Е1.2 F1.1 G1.1

4

16

А1.2 В1.2 С1.2 D1.4 Е1.2 F1.1 G1.1

2

17

А1.5 В1.2 С1.1 D4.4 Е1.1 F1.1 G1.1

2

18

А1.2 В1.2 С1.1 D4.4 Е1.1 F1.1 G1.1 + В-хромосома

2

19

А1.2 В1.1 С1.1 D1.4 Е1.1 F1.1 G1.1 + В-хромосома

2

20


А1.2 В2.2 С1.1 D1.4 Е1.1 F1.1 G1.1 + В-хромосома

2

21

А1.2 В1.2 С1.1 D1.4 Е1.1 F1.1 G1.1 + В-хромосома

2


Выявлены различия в активности NО на основе естественного полиморфизма между группами личинок с разными генотипическими комбинациями: pluA1.2D1.4 и plu B1.2D1.4; plu A1.2B1.2D1.4 и plu B1.2D1.4; plu A1.2B1.2 и plu B1.2D1.4.

Наибольшая активность NО наблюдалась у личинок с plu B1.2D1.4. У гетерозиготных по последовательности plu В2 личинок по сравнению с гомозиготными (plu В1.1, и plu В2.2) активность BRB увеличена за счет территориального сближения PB и BRB в результате гетерозиготной инверсии. При анализе активности функциональных участков ПХ в зависимости от числа инверсий в кариотипе выявлено увеличение активности BR2G у личинок с наименьшим числом гетерозиготных инверсий, значение BR2GR увеличивалось (от 1.59 при трех инверсиях до 1.63 при двух и 1.88 при одной). Отмечена тенденция к уменьшению разброса значений индексов функциональной активности ПХ в группе подопытных личинок по сравнению с контролем (табл. 3).

Снижение разнородности работы активных участков ПХ личинок в условиях стрессового воздействия токсикантов свидетельствует о мобилизации внутриклеточных ресурсов, подавляющих проявление индивидуальных реакций особей на основе естественного генетического полиморфизма, и позволяет в экспериментах на генотоксичность пренебрегать индивидуальными различиями функциональной активности ПХ особей с разными зиготическими комбинациями.


Таблица 3

Величина дисперсии в период акклимации и при воздействии холинотроных

препаратов

Индекс активности ПХ


В период акклимации

воздействие

Вероятность сходства дисперсий в контроле и в эксперименте при р≤0.05

CR

5,96

4,57

<0.01

NОR

0,49

0,44

0.02

BRBR

0,17

0,12

<0.01

BR2GR

0,2

0,04

<0.01

PBR

0,05

0,04

<0.01



следующая страница >>